“一花一世界”，這句充滿禪意的話在微觀視野中得到完美詮釋。而構(gòu)成世間萬千紛繁的原子由化學(xué)鍵聯(lián)合為分子，不同的分子往往具有特異性的化學(xué)鍵振動(dòng)，成為它們的指紋特征。相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）顯微術(shù)便是通過探測(cè)目標(biāo)分子的特征振動(dòng)來提供成像所需的襯度, 同時(shí)基于非線性光學(xué)過程大大增強(qiáng)拉曼散射的信號(hào)，提高成像速率以及檢測(cè)靈敏度的新型顯微技術(shù)^[1][2]。

▲水分子的三種振動(dòng)模式示意

1. 免標(biāo)記和分子特異性：CRS 成像的信號(hào)來源于目標(biāo)分子本身，無需外源標(biāo)記物，也避開了藥物小分子等不易標(biāo)記的問題，在活體（in vivo）觀測(cè)上更具有優(yōu)勢(shì)；可對(duì)具有不同拉曼譜的分子進(jìn)行選擇性成像，比如生物樣品里常見的脂質(zhì)、蛋白、核酸和糖類等（如圖 1）；

2. 較高的探測(cè)靈敏度：相比于自發(fā)拉曼，成像速度一般有 3-5 個(gè)數(shù)量級(jí)的提升，一定條件下可實(shí)現(xiàn)視頻成像速度（每秒幾十幀）；

3. 光學(xué)層析和三維掃描：類似多光子顯微鏡的光學(xué)層析和三維成像功能；且由于所用的激發(fā)波長(zhǎng)一般在近紅外，有較好的穿透深度和更小的光毒性。

根據(jù)非線性光學(xué)過程的不同，可將相干拉曼散射分為兩種：相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-Stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。雖然這兩種非線性光學(xué)現(xiàn)象很早就被發(fā)現(xiàn)（上世紀(jì) 60 年代），但長(zhǎng)期僅作為光譜學(xué)測(cè)量手段，直到 1999 年以及 2008 年，哈佛大學(xué)謝曉亮教授才分別將它們以實(shí)用顯微成像技術(shù)推廣開來^[4][5]。

自發(fā)與相干拉曼散射的能級(jí)示意圖見圖 2。自發(fā)拉曼只需要一束激發(fā)光，稱為泵浦光（ω_p），泵浦光子與分子發(fā)生非彈性碰撞，將部分能量轉(zhuǎn)移給分子振動(dòng)。因此散射出來的光相對(duì)于泵浦光將發(fā)生一系列的頻率紅移，稱為斯托克斯光（ω_s），對(duì)應(yīng)到光譜儀中的一系列譜峰，成為該分子的指紋特征。泵浦和斯托克斯光子的頻率差正好共振于化學(xué)鍵的振動(dòng)頻率（Ω=ω_p-ω_s），滿足能量守恒。對(duì)于相干拉曼散射，需將泵浦和斯托克斯這兩束激光同時(shí)作用于分子，當(dāng)它們的頻率差（拍頻）共振于某個(gè)化學(xué)鍵的振動(dòng)時(shí)，大量分子的同一個(gè)振動(dòng)模式將被同步（相干地）激發(fā)起來，使得散射效率得到大大地增強(qiáng)。最終表現(xiàn)為：泵浦光減弱（受激拉曼損失，SRL）、斯托克斯光增強(qiáng)（受激拉曼增益，SRG），并且出現(xiàn)反斯托克斯（ωas=2ωp-ωs）的新頻率分量（CARS）。自發(fā)拉曼散射與熒光、吸收等同屬線性光學(xué)范疇，一般使用連續(xù)激光即可。相干拉曼與雙光子熒光、二次諧波等都屬非線性光學(xué)范疇，需使用超短脈沖激光。最常見的用于相干拉曼的光源是皮秒光參量振蕩器（OPO），輸出兩路皮秒光，一束波長(zhǎng)固定（如 1064nm），另一束波長(zhǎng)在近紅外區(qū)間可調(diào)，它們分別作為斯托克斯和泵浦光。調(diào)節(jié)激光波長(zhǎng)使得我們可以改變待測(cè)拉曼頻率，選擇性地去探測(cè)不同的化學(xué)鍵/分子。

CARS 與 SRS 雖然都是三階非線性光學(xué)過程，它們之間有明顯的區(qū)別：CARS 是個(gè)四波混頻過程，產(chǎn)生的光子具有第三種頻率——反斯托克斯光子 ω_as，因此只需采用合適的濾波片就可以簡(jiǎn)單地提取出來；而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之間的相互轉(zhuǎn)化過程，泵浦光子的湮滅和斯托克斯光子的產(chǎn)生同時(shí)發(fā)生，但沒有產(chǎn)生第三種光子；因此，通常用泵浦-探測(cè)技術(shù)中常見的調(diào)制解調(diào)的方式來提取信號(hào)，需要借助鎖相放大器來實(shí)現(xiàn)。CARS 顯微成像技術(shù)自 1999 年被發(fā)明以來，一直受困于非共振背景信號(hào)的干擾，典型的表現(xiàn)為光譜發(fā)生畸變（圖 3）。在苦苦求索了近 10 年之后，謝教授課題組于 2008 年推出了 SRS 技術(shù)，完美地解決了上述問題。CARS 過程中能量被封鎖于電磁場(chǎng)/光子中，電子躍遷可繞過分子振動(dòng)直接通過虛能級(jí)產(chǎn)生；而 SRS 的發(fā)生依賴于光子能量與分子振動(dòng)之間的交換，具有嚴(yán)格的共振吸收特征。因此 SRS 在光譜上與自發(fā)拉曼一致（圖 3），在圖像上也不再受非共振背景的困擾（圖 4）。此外，SRS 的信號(hào)與分子濃度呈線性關(guān)系，更方便于定量解析復(fù)雜混合物體系中的各種化學(xué)成分。也因?yàn)檫@些特性，SRS 不斷獲得研究者們的青睞。

參考文獻(xiàn)：

1.Alfonso-Garcia, A., Mittal, R., Lee, E. S. & Potma, E. O. Biological imaging with coherent Raman scattering microscopy: a tutorial. J Biomed Opt 19, 71407,